荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer, FRET)

荧光共振能量转移（FRET)是一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态的过程。此过程没有光子的参与，所以是非辐射的。该分析方法具有快速、敏感和简单等优点。

用于FRET试验的染料是可以相同的。但在大多数应用中其实是使用不同的染料。简单地说，荧光共振能量转移是在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体(染料1)向受体(染料2)转移的过程。通常，供体 （Donor）荧光基团的发射光谱要与受体（Acceptor）基团的吸收光谱有一定的重叠。当这两个荧光基团间的距离合适时（10 – 100 Å)），就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象。能量转移发生方式依赖于受体的化学结构：

• a) 被转化为分子的振动，即发生能量转移荧光熄灭。(受体是猝光剂)
• b) 发射更强于受体本身的特征荧光，造成次级荧光光谱的红移。 (受体是荧光发射体)。

一个供体基团（EDANS）和接受基因（DABCYL）匀被连接到一HIV蛋白酶的天然底物上，当该底物未被切断时，DABCYL可淬灭EDANS，从而检测不到荧光。当该底物被HIV-1蛋白酶切断后，EDANS不再被DABCYL淬灭，随即可检测到EDANS荧光。蛋白酶抑制剂的有效性可凭借EDANS荧光强度的变化进行监测。

FRET肽是研究肽酶特异性的便利工具，由于其反应过程可被连续监测，为酶活性的检测提供了一个便捷的方法。供体/受体对的肽键水解后产生的荧光可衡量纳摩尔级浓度的酶活性。当FRET肽是完整的，表现出的是内部的荧光猝灭，但当供体/受体对的任何肽键断裂就会释放出荧光，此荧光可被连续检测，从而可对酶的活性进行定量分析。

FRET 肽可作为各类酶研究的合适底物，比如：

1. 肽酶、蛋白酶、激酶、磷酸酶的动力特征和功能特征。
2. 对新的蛋白水解酶的筛选和检测。
3. 对多肽折叠的构象研究。

以下是一些用于FRET的标准染料组合::

1. Fluorescein and Dabcyl:FAM/Lys(Dabcyl)
2. Fluorescein and Tamra: FAM/TAMRA
3. Methoxy-coumarin-acetic-acid(MCA) and 2,4-Dinitrophenyl(DNP): MCA/Lys(Dnp).
4. Ortho-aminobenzoic acid (Abz) and 2,4-dinitrophenyl (Dnp) or N-(2,4-dinitrophenyl)ethylenediamine (EDDnp): Abz/Tyr (NO2), Abz/EDDnp
5. Dabcyl and Glu(EDANS)

在蛋白酶的多肽底物内经共振能量转移引发荧光猝灭的供体-接受对

常规RET供体-接受对的福斯特临界距离（Forster Critical Distance）

(1): 5-(2-iodoacetylaminoethyl)aminonaphthalene-1-sulfonic acid
(2): N-(4-dimethylamino-3,5-dinitrophenyl) maleimide
(3): carboxyfluorescein succinimidyl ester
(4): 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene